第四节 性别控制技术

一、精子的性别分离

    哺乳动物精子可分为两类，一类携带x染色体(x精子)，一类携带Y染色体(Y精子)。这两类精子在比重、体积、表面电荷、表面抗原等方面略有差异。据此人们设计了诸如沉降法、离心法、过滤法、电泳法、H—Y抗原法等方法分离这两类精子，以期达到控制后代性别的目的。理论上讲这是控制性别最经济、最有效的方法。然而迄今为止，应用这些方法，在一些实验中虽曾得到较满意的结果，使某一性别的后代明显地多于另一性别，但这只在一定程度上改变了后代出生的性别比例，并没有超出自然出现的性别比例范围，因此不是完全控制性别。而且许多实验重复性、稳定性整，很难在实际生产中推广应用。近年来发展起来的细胞流式分类器在分离两类精子上显示出较大的优势。其原理是X精子DNA含量略高于Y精子。操作方法是用无毒性作用的活体染料将精子染色，染色的活精子逐个通过细胞分类器的微柱。此时，用一束激光激发荧光染料，使通过微柱的精子发光。x精子发光量略高于Y精子。这种发光亮的微小差别由光学测定仪记录并把信号送给电脑。精液通过激光束后，便被分成微滴。电脑把电子信息反馈到产生微滴的部位，使每个微滴带电。x精子带正电，Y精子带负电。当带电精子进入电场后，两类精子便分别向不同的方向移动，进入不同的容器。分离后的部分精子未受损伤，可用于受精。据Johnson报道，用分离得到的兔X精子输精，获得的仔兔94％为雌兔。

    细胞流式分类器目前还不可能进入实用阶段，一方面是由于分离精子的速度很慢，每小时只能分离35万个精子。另一方面，这种仪器价格昂贵，一般的生产单位无力支付如此高的费用。

二、早期胚胎性别鉴定

    哺乳动物早期胚胎的性别鉴定技术业已成热，鉴定的准确率比较高。目前，早期胚胎性别鉴定的方法主要有以下几种。

    (一)细胞遗传学法

    该方法是通过核型分析来完成胚胎性别鉴定的，是最早用于兔、羊、牛胚胎性别鉴定的方法。其操作过程如下：先取少量的胚胎细胞，在含有秋水仙素的培养液中培养，由于秋水仙素的阻抑作用使细胞的有丝分裂停留在中期，在渗透压的作用下使细胞膨胀，细胞壁破裂，染色体被释放，然后经固定和姬姆萨染色后在显微镜下观察。由于有丝分裂被阻滞在中期，故染色体缩短，形状规则，并有特异的带型，通过核型分析，确定其性染色体类型属XX还是XY型，这种方法鉴定胚胎性别的准确率几乎是100％，但操作过程比较烦琐。

    (二)X染色体连接酶活力测定法

    哺乳动物性染色体的类型，雌性为XX而雄性为XY型，为了维持性别之间的基因平衡，在胚胎发育的早期，雌性个体每个细胞中的一条x染色体是失活的，尽管这条x染色体失活的确切时间尚不知道，但可以肯定的是在这条染色体失活前有一段时间，两条X染色体均有活性，并进行转录，这表现在胚胎发育的早期，雌性胚胎x染色体连锁酶的活性是雄性胚胎的两倍。依据这一事实，Williams和Monk等检测了小鼠桑椹胚至囊胚期这段时间X染色体连锁酶的活性，即葡萄糖-6—磷酸脱氢酶的活性，以预测胚胎的性别，移植后分娩结果表明雌性、雄性胚胎的准确率分别为72％、57％。这种方法鉴定胚胎的准确率较低，主要原因是不知道X染色体失活的确切时间。

    (三)H—Y抗原法

    目前利用H-y抗原进行胚胎性别鉴定的方法有两种，即细胞毒性分析法和间接免疫荧光法。

    1.细胞毒性分析法

    将胚胎培养在含有H-Y抗血清与补体(豚鼠血清)的培养液中进行培养，有H-Y抗原的胚胎表现出一定的细胞溶解，此类胚胎被判为雄性胚胎。能够继续发育即H-Y阴性的胚胎移植后所生仔鼠有86％为雌性。该方法以破坏雄性胚胎为代价，故现已很少采用。

    2．间接免疫荧光法

    先将8细胞至囊胚期胚胎与H-y抗体反应30分钟，再与用异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记的免疫球蛋白M(IgM)抗体反应。然后在荧光显微镜下检查胚胎是否带有荧光素，若有荧光素则被判定为雄性。此法主要优点是不损害胚胎，准确率比较高，猪、绵羊、牛雌性鉴定准确率分别可达81％、85％和89％。但该方法需要荧光显微镜和丰富的经验。

    (四)Y染色体特异性DNA探针法

    应用这一方法必须经过复杂的技术过程制备特异性的、经同位素标记的Y染色体特异序列的探针，用这一探针与从胚胎细胞中提取出的少量DNA杂交，杂交结果呈阳性的说明有Y染色体，可判为雄性。该方法准确率达90％。

    九十年代初，英国学者发现了存在于Y染色体短臂上的、决定雄性的DNA片段，定名为SRY，即性别决定区(基因)。这一发现被认为是九十年代以来生物科学的重大成就之一，为进一步开展性别控制研究奠定了基础。将其与聚合酶链反应(PCR)扩增技术相结合，应用于胚胎性别鉴定，准确率可达100％；国内研究者已成功地用PCR技术直接扩增牛胚胎的SRY特异DNA序列，能够准确地鉴定牛胚胎的性别。

    三、出生前胎儿的性别确定
   
    在出生前确定胚胎性别是通过测定羊水中的激素含量，或分析性染色体，或用Y染色体特异性DNA操针检测从羊水中分离获得的细胞，以确定性别的方法。如果胎儿性别不是所需要的，则可实施流产，据报道从怀孕30～40天的牛早期胚胎活组织采样，经染色体分析可以确定胎儿的性别，但这种方法同样要对不需要的胎儿实施流产。

    此外，外界环境中的某些因素如母畜营养水平、配种年龄与时间、生殖道环境等都能不同程度地对性比产生影响，从而使性比发生变化。

    总之，影响性比的因素很复杂。通过进一步研究，建立实用、稳定、准确的性别控制方法，应用于畜牧业生产，必将产生巨大的经济效益。