第二节 胚胎冷冻与体外受精
二、体外受精
体外受精技术是动物胚胎工程的重要研究内容之一。自从1951年Chang和Austin分别发现哺乳动物精子获能现象之后，体外受精技术的研究得到了飞速发展，到目前为止，已先后在家兔(1959)、小鼠(1968)、大鼠(1974)、牛(1982)、狒狒(1984)、恒河猴(1984)、猕猴(1984)、绵羊(1985)、山羊(1985)和猪(1986)等动物以及人(1978)获得了试管后代。在国内，已先后在小鼠(1986)、兔(1987)、绵羊(1989)、牛(1989)、猪(1990)和山羊(1991)等动物以及人(1988)取得成功并获得了试管后代。
体外受精技术的发展为体外工厂化大量生产质优价廉的胚胎提供了可能。随着胚胎移植技术的推广应用和胚胎国际贸易的发展，对胚胎，尤其是牛胚胎的需求量日益增加，大大推动了对牛体外受精及相关技术的研究。目前通过大量试验，逐步建立了较完善的卵泡卵母细胞体外成熟培养系统，确立了有效的精子处理与体外获能方法以及体外受精条件，筛选出数种早期胚胎体外发育的共同培养系统。许多学者将牛卵泡卵母细胞体外成熟—体外受精—早期胚胎的体外发育，甚至冷冻保存结合在一起，生产出了大量试管犊牛，逐步建立了工厂化生产胚胎的成套技术，在英、日、美等一些发达国家已成立了有关开发公司。
图10-5：体外受精技术
(一)卵母细胞体外成熟
在自然繁殖的状况下，母畜卵巢上绝大多数卵母细胞发育到一定程度后即发生闭锁。应用超排技术可以获得较多的成熟卵子，从而提高母畜繁殖效率。除此之外，利用屠宰场母畜的废弃卵巢，是挖掘母畜繁殖潜力的另一重要途径。
1．卵巢上卵子的采集方法
母畜屠宰剖腹后，立即无菌采集卵巢，一般置于30～37℃的无菌生理盐水中保温并尽快带回实验室，以不超过4h为宜。在无菌操作室内，用洗涤液洗卵巢2～3次，然后用抽吸法、剥离法或切开法等将卵子从表面卵泡中吸出，置于离心管中静置10～15分钟，然后在实体显徽镜或倒置显微镜下选出可培养的卵子，并将之置于培养液中。此外，也可以通过剖腹术或腹腔镜技术从活体卵巢上采集卵子。
收集到的卵子一般分为四类，第一类是形态正常、卵丘细胞致密的卵子；第二类是卵丘细胞部分脱落的卵子；第三类是卵丘细胞全都脱落的裸卵；第四类是细胞质发黑，卵丘细胞松散的退化卵子。其中，一、二两类卵子可用于体外培养。
目前所采集到的卵母细胞主要来源于卵巢表面的大卵泡，在牛每个卵巢平均可获得约5枚可用卵，面对于数量更多的卵巢内卵泡甚至腔前卵泡卵母细胞并未得到有效利用。近年来，一些研究表明用特制切割刀直接纵横切割牛卵巢可提高采卵率3～4倍。在小鼠、大鼠、仓鼠、兔等动物上已初步建立了有效的分离腔前卵泡的方法，并在小鼠、大鼠上进行了卵母细胞体外发育培养，体外受精后分别获得了后代和早期胚胎。在家畜腔前卵泡的分离上也进行了初步尝试。总之，提高卵巢卵母细胞的利用率，充分发挥优良母畜的繁殖潜力仍是今后一个重要的研究课题，其中首先要建立快速有效的分离采集方法。
2．未成熟卵子的培养
卵巢上采集的卵子尚未完全成热，需要进一步成热培养。目前用碳酸氢钠或Hepes缓冲的TCM—199因其良好的培养效果而被广泛采用。此外，研究者们模仿卵子在卵泡内的发育环境；在卵子培养液中加入cAMP、生殖激素、血清、生长因子等，培养效果有一定的提高。添加的生殖激素的种类主要有FSH、17β--雌二醇、hCG等。
在培养液中加入适量FSH的作用是刺激卵丘细胞间质中的透明质酸分解，诱导卵丘扩散，促进卵母细胞成熟，使得精子易于穿过。而培养液中的犊牛血清、血清白蛋白、乳酸、丙酮酸钠等成份都有利于卵子的正常发育。卵子一般在39℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养20～30小时。此时，卵丘细胞充分扩张，从形态学上即可认为卵子达到成熟。但检查卵子培养效果最准确依据是受精试验。
(二)精子体外获能
主要包括精子洗涤与某些特定成份诱导精子获能两个方面。无论是鲜精还是冻精，一般都要经过数次离心洗涤以除去精清成份、加入的稀释液成份、死精以及冷冻保护剂如甘油等，以达到获得高浓度的活力旺盛的清子之目的。牛精子洗涤剂量常用的有BO液和改良Tyrode液两大类，获能方法也因所选用的洗涤剂不同而异。绵羊、山羊与牛的方法相似，猪上略有差异。
1．BO液类
一般用不含BSA的BO液离心洗涤二次，调整精子浓度为1～10x106个／ml，然后用咖啡因、肝素、BSA、钙离子载体(IA)等一种或数种物质协同诱导精子获能。
2．改良Tyrode液类
冻精活力比较低，一般需要用上浮法(Swim-up，即让活精子浮游到上层)或Percoll梯度法来分离并获得高浓度的活精子。然后经过离心洗涤，调整浓度，最后在含有10mg／ml的肝素获能液中孵育15分钟。
(三)体外受精
一般将成熟的卵母细胞移入受精液微滴中，再加入获能精液。微滴以50～100ul为宜，每滴中加入5～10个卵母细胞，精子最终浓度为0.64～1x106个／ml。在39℃，5％CO2气体中精卵共同墙养。Tyrode液中需18～24h，BO液中仅需6－8h。
(四)早期胚胎的体外发育培养
许多动物早期胚胎均存在“体外发育阻滞”现象。即“阻滞期”前的胚胎发育到该时期后都要受到不同程度的阻滞，牛、绵羊为8—16细胸、山羊为2细胞、猪为4细胞期阻滞。体外受精胚或核移植重组胚在无血清的特定培养液中，很难有效地突破阻滞期，发育到更易保存和用途广泛的桑椹胚或囊胚期。目前在哺乳动物尤其是在牛上进行了大量的研究。一般都是在5％CO2，38～39℃，饱和湿度，碳酸氢钠或Hepe's缓冲的TCM-199培养条件下，采用与其它细胞共同培养的方法来促进早期胚胎的体外发育。这类细胞的类型很多，如卵丘／颗粒细胞、输卵管上皮细胞、成纤维细胞、滋养层细胞、黄体细胞或其它体细胞等，但仍存在着囊胚发育率低的问题，有待于进一步改善培养条件。
(五)精子显微注射
精子显微注射是指采用显微操作方法将处理后的精子核或完整的精子直接注入卵质，完成受精过程。作为一种新的辅助受精方法，精子显微注射无论是从理论上还是实践上都具有重要的意义。因为这种方法使参与受精的精子越过了透明带及精—卵膜融合这两个障碍，精子无需有运动能力。这对于利用极有价值而数量又非常有限的精子是很有优势的。此外，精子显微注射可以使那些先要破坏精子的运动方能进行的技术措施得以实施。如借助于细胞流式分类器进行的携带X染色体和携带Y染色体精子的分离技术，该技术要求脱去精子的尾部，而脱去尾部的精子采用显微注射的方法即可解决这一问题。这也增加了流式分类器作为分离精子的技术在生产上应用的可能性。
精子显微注射的基本程序是：
1.精子注射前处理。通常用于注射的是精子核，因而要采用一系列的方法分离、制备完整的精子核。其方法是用含一定量的聚乙烯吡咯酮的稀释液固定精子，然后用显微注射针吸取单个精子的核；
2．借助显微操作仪将核直接穿过透明带和卵膜注入卵质中；
3．注射后的卵母细胞在体外进行培养，观察其卵裂及发育情况，并确定这样的卵裂球能否用于移植。