第二节 胚胎冷冻与体外受精
一、胚胎冷冻
(一)概况
胚胎冷冻就是将胚胎置于超低温环境中(－196℃)保存，其新陈代谢及发育完全停止，但仍具有活力，一旦解冻、移植即可产生后代。这具有重大实用价值：
1．建立胚胎库，保存优良家畜与濒危动物资源
胚胎的低温保存技术，是保存某些特有家畜品种和野生动物资源的理想方法，可防止因疾病或其它原因丢失的各种动物品种、品系和稀有突变体遗传资源的保存。
2．可使胚胎移植不受时间与地点的限制
鲜胚移植时需要对足够数量的受体进行同期化处理，既费人力又费物力，而冻胚则可以待有合适的受体时再解冻移植，从而使胚胎的移植技术更便于在生产中推广应用。
3．便于胚胎运输以取代种畜引进
既可以大大降低购买和运输的费用，又可以减少疾病的传播。此外，由外地引进的胚胎在当地母畜子宫内发育到分娩，胎儿可以从母体获得一定的免疫能力，加上在当地生长成热，因此较直接引进的种畜更容易适应当地的生态环境。实际上，特别优秀的种畜往往价格极为昂贵或者根本不出售，而购买与优秀种畜血统相同的高质量胚胎则是可行的。
哺乳动物胚胎冷冻技术于1972年由Whittingham在小鼠上首次取得成功。以后牛(Wilmut等，1973)、绵羊(Willadsen等，1974)、山羊(Bilton等，1976)和马(Ramamoto等，1982)等动物的冻胚移植相继成功。欧、美、日、加等国家已建起牛胚胎移植公司，国际间胚胎贸易得到快速发展。在国内，绵羊、兔、牛、山羊等动物冻胚移植均获成功，并开始逐步走向生产。
(二)冷冻原理
与精子等其它生物细胞相似，胚胎在0℃以下会导致死亡，而且胚胎细胞为正在发育的细胞，水分占80％以上，其抗冻性能较高度浓缩的精子细胞差．更易受冷冻破坏。这是由于胚胎在冷冻过程中，一方面细胞外水分首先形成冰晶，引起渗透压升高，使细胞脱水、蛋白质变性即产生所谓的溶液效应。另一方面，来不及渗出的水分在胞内形成大的冰晶而致细胞死亡。哪一方面占优势则取决于降温速率。胚胎冷冻是利用低温生物学原理，在胚胎冷冻前加入抗冻保护剂，充分平衡，并采用适宜的冷冻方法，可以尽量避免冷冻过程中胚胎细胞内大冰晶形成及胞外溶液效应达到有效冷冻保存胚胎的目的。冷冻保护剂的种类很多，常用的有甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇等，可单独或有选择地结合使用。在快速冷冻中，一方面加入甘油等保护剂，防止由于溶液效应而使细胞脱水及蛋白质变性；另一方面在稍低于溶液冰点时人工强行诱导结冰，以免出现溶液过冷现象，防止结冰时释放潜热引起温度回升，以及形成大的冰晶，减轻对胚胎的损伤。在一步冷冻中．选用高浓度的渗透性保护剂组成的玻璃化溶液，在冷冻过程中，不发生结晶而形成玻璃样固体，维持液态时的正常分子与离子分布，使细胞内发生玻璃化而起到保护作用。
(三)胚胎冷冻方法
冷冻的方法很多，可以归纳为缓慢降温法、快速冷冻法和一步冷冻(直接冷冻)法三种。
1．缓慢降温法
为最早采用的方法。加入保护剂后，以0.2～0.8℃／分的速率降至－196℃后投入液氮。同样解冻也需要缓慢升温。此法冷冻解冻过程耗时太长，现已淘汰。
2．快速冷冻法
为目前最成熟的方法。与一步法相比，虽然操作比较繁杂，需要专门的冷冻仪，但胚胎解冻后存活率及移植成功率较高，为目前生产中最常用的方法，其具体操作步骤如下：
(1)胚胎的采集及洗涤 用手术法或非手术法采集胚胎后，选择形态正常的桑椹胚或囊胚在含20％犊牛血清的PBS中洗涤两次。
(2)加入冷冻液 洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4M甘油的冷冻液中平衡20分钟。
(3)装管和标记 按图10-8类似的装管方法将胚胎和冷冻液装入0.25ml细管中，封口，并在细管外标记供体号，胚胎数量，等级，冷冻日期等。
(4)冷冻和诱发结晶(植冰)
将装入细管的胚胎放人冷冻仪中，在0℃平衡10分钟，以1℃／分的速度降至-6～-7℃，在此温度下诱发结晶，并平衡10分钟。然后以0.3℃／分的速度降温至-35～-38℃，投入液氮保存。
(5)解冻和脱除保护剂
从液氮中取出装胚胎的细管，立即投入37℃水浴中，并轻轻摆动，1分钟后取出即完成解冻过程。然后用0.2～0.5M蔗糖PBS液分两步或一步法脱除冷冻保护剂使胚胎复水，最后移入PBS培养液中准备移植。
此外，目前研究的细管内一步解冻方法，选用乙二醇等对胚胎无毒害作用的保护液，装管时含有胚胎的保护液占1份，两端的PBS液共占3份。按快速法冷冻解冻后，在细管内直接脱除或不脱除保护剂即可直接移植。该方法简化了程序，便于胚胎移植推广，但有待改进提高妊娠率。
3．一步冷冻法
采用25％的甘油、丙二醇、乙二醇中的任何两种保护剂组成高浓度的玻璃化液。胚胎分两步移入低、高浓度的保护剂中，装入细管并在4℃平衡10分钟，然后直接或在液氮蒸气中放置1～2分钟投入液氮。解冻后可分两步法脱去保护剂。此法操作简便，不需要专门的冷冻仪．为将来发展的方向，但成功率较低，生产中推广受到限制。